Vad är flödescytometri?

August 15

Flödescytometri är studiet av enskilda celler när de passerar genom en vätskeström. Komponenter i cellen, antingen internt eller på ytan, först måste märkas med en eller flera fluorescerande färgämnen. En laser inuti ett instrument som kallas en flödes exciterar cytometer dessa fluorescerande molekyler så att de emitterar ljus vid olika våglängder. Mängden fluorescens kan ge en indikation om hur stor andel av olika celltyper är närvarande i provet. Flödescytometri används i laboratorier för en mängd olika tillämpningar inklusive cancerforskning, immunologi och cellcykelanalys.

För att utföra flödescytometrianalys, måste en suspension av enskilda celler färgas med fluorescerande färgämnen, vilket kan göras i antingen en enstegs- eller två-stegsprocess. Cellulära proteiner är ofta färgades med användning av antikroppar riktade mot proteinet av intresse. En en-stegsprocess involverar färgningsceller med antikroppar som redan är märkta med fluorescerande färgämne. Om märkta antikroppar inte är tillgängliga, kan celler färgas först med en omärkt primär antikropp, och sedan med en fluorescerande märkt sekundär antikropp.

När cellerna är märkta, är de redo för flödescytometrianalys. Ett rör innehållande suspensionen av celler är laddad på flödescytometern. Cellerna flöda genom instrumentet och passerar framför en laser i en enda fil. Som lasern träffar varje cell, är det ljus som sprids i en framåt eller sidoriktning. Forward mätningar scatter ger en indikation på cellstorlek, medan sidospridning är ett mått på granularitet av cellerna.

Energin från lasern exciterar också fluorokromen molekyler, det fluorescerande färgämnet användes för att färga cellerna. En vanlig laser som används för flödescytometri är argonjonlaser som emitterar ljus vid en våglängd på 488 nanometer (nm). Detta ljus exciterar molekyler av det gröna färgämnet fluorescein, som sedan sänder ut ljus vid en våglängd av 525 nm. Fotomultiplikatorrör (PMT) i flödet har cytometern ljusfilter som upptäcker det utsända ljuset från de olika fluorokromerna. Instrumentet kan ha flera PMTs som upptäcker ljus vid olika våglängder.

Röd-diod, violett diod, eller He-Ne (helium-neon) är andra lasrar som kan användas i en flödescytometer. Andra fluorokromer används i flödescytometrianalys inkluderar fykoerytrin, Texas rött, eller allofykocyanin. Olika kombinationer av lasrar och fluorokromerna tillåter forskaren att samla in information om många olika cellulära markörer i samma experiment.

Programvara konstruerad för användning med flödet hjälper cytometern forskaren visualisera data. Cellpopulationer analyseras med punktdiagram, densitet tomter eller histogram. Regioner kan dras runt cellerna av intresse och fluorescensintensitet kan ge en indikation på procentandelar av olika celler i provet.