Vad Är Isoelectric Point?

August 20

Proteiner är byggda av kedjor av aminosyror, vilka var och en har olika pH-värden. Den totala pH-värdet för proteinet är sammansatt av blandningen av pH-värdena hos de individuella aminosyror, som de bildar joner i den särskilda lösning i vilken de löses. Den isoelektriska punkten (pl) av ett protein är det pH vid vilket det proteinet inte har någon nettoladdning. Denna egenskap kan utnyttjas för att separera proteinet med den kända pl från andra proteiner i en heterogen blandning.

Aminosyror har en aminoterminal grupp som är grundläggande, som har ett högt pH. Den andra änden av aminosyran är den karboxylterminala som är sur, med ett lågt pH. Vid olika pH-värden, kommer aminosyrorna på proteinerna varierar i sina avgifter. Proteiner under deras isoelektriska punkt har en positiv laddning. Däremot, de över denna punkt har en negativ laddning.

För att utnyttja kunskap om den isoelektriska punkten för proteinrening, är en blandning av proteiner utsattes för ett elektriskt fält. Detta görs vanligtvis i agaros- eller polyakrylamidgeler, och är känd som isoelektrisk fokusering. En äldre teknik är att utföra proceduren i större skala i en glaskolonn med användning av en lösning av sackaros med elektroder på varje ände. Föreningar som kallas amfolyter läggs som orsakar bildandet av en konsekvent pH-gradient. När gel eller kolumnen utsätts för den elektriska strömmen, proteinerna vandrar tills de når sin isoelektriska punkt, och sedan stå stilla.

Proteiner på geler är i allmänhet gjorda synliga genom ett färgämne som binder proteiner. Ibland, om enzymer studeras, ett substrat kan användas som ger en färgad reaktions. Vanligtvis standarder används som har proteiner av kända isoelektriska punkter.

När en vet var det önskade proteinet är beläget, är en vanlig teknik för att skära det isolerade proteinet ut ur gelén. Proteinet kan sedan renas och sekvenseras. När väl sekvensen är känd, kan den användas för att utforma primrar för polymeraskedjereaktion (PCR) och användes för att klona genen för proteinet om lämplig nukleinsyramaterialet finns tillgängligt.

Isoelektrisk fokusering är också ett vanligt sätt att analysera närbesläktade proteiner för att se hur olika de är från varandra. En komplikation kan vara att proteiner kan ha socker bundna till dem. Detta kallas glykosylering och kan påverka proteína € s pl. Det kan se ut som det finns flera proteiner med olika isoelektriska punkter, när det i själva verket finns det bara en protein som har differentiellt glykosylerat. Proteiner renas genom standardmetoder, såsom kromatografi ibland analyseras genom isoelektrisk fokusering för att säkerställa deras renhet.